2019年10月1日，5-羟甲基（jī）化胞嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖（táng）尿病研究（jiū）领域取得重要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发症是（shì）导致2型糖（táng）尿病致残致死的重要病因，一直缺乏一种无创便捷的（de）临床（chuáng）途径实现血管并发症的发生发展监（jiān）测，达到早发现、早干预（yù），以提高T2D病人的整体生活质（zhì）量，减（jiǎn）少（shǎo）卫（wèi）生经济负担。

该（gāi）研究入（rù）组了62例（lì）2型糖尿病病（bìng）人，采（cǎi）用（yòng）5hmC-Seal技术对（duì）血浆（jiāng）cfDNA中（zhōng）表观遗传标志物5hmC的（de）分布情况（kuàng）进行（háng）检测（cè），分析5hmC标志物与2型糖（táng）尿（niào）病血管并发（fā）症（zhèng）发生发展的相关性。结（jié）果表明5hmC标（biāo）志物的变化与T2D合并大（dà）血管/微血管事件具有相关（guān）性，主要涉及（jí）一些与血管生物学和糖尿病（包括胰岛（dǎo）素耐（nài）受和炎症反应（yīng））相关（guān）的基因（yīn）和信号通路。该研（yán）究建立的16个基因-5hmC标志物（wù）组合检测可以准确区分有（yǒu）并发症（zhèng）和（hé）无并发（fā）症的2型糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于（yú）传统临床变量例（lì）如白蛋白尿。除此之（zhī）外，还建立了13个基因-5hmC标志（zhì）物组合检（jiǎn）测，可以进一（yī）步区分T2D合并单一并发症和（hé）多种（zhǒng）并发症[实验组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显（xiǎn）优于其他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反映了（le）T2D病（bìng）人大血管/微血管并发症发（fā）生过程中的表观遗传变化，因而5hmC-Seal检测技术在监测糖尿病血管并发症发（fā）生和进展方面具有良好的（de）临床应用前（qián）景（jǐng）。

本（běn）研究共纳入62例2型糖尿病病人，包括没有血管（guǎn）并发症的（de）病人（rén）12例，有单一血管并（bìng）发症的病人（rén）34例（24例发生大血管（guǎn）事（shì）件，10例发生微血（xuè）管事件），以及有（yǒu）多种血管并发症的病人16例。试验收（shōu）集62例病人（rén）血浆（jiāng），提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外（wài）周血（xuè）cfDNA中的5hmC序列（liè），进行二代测序，通（tōng）过生物信（xìn）息学分析找（zhǎo）出并（bìng）发症组与无（wú）并发症组之间有显著5hmC修（xiū）饰差（chà）异的基因，单一并发症组和多种并发症组之间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模型对差（chà）异基因进一步筛选、优化，弹性网（wǎng）络进一步筛选，计算（suàn）加权（quán）平均分，最后得到（dào）一（yī）组（zǔ）具有高度灵敏度和特异性的5hmC生物标记物，并进一（yī）步在（zài）实验组（zǔ）中（zhōng）验证（zhèng），分析其灵（líng）敏度和特异性。并将新（xīn）建立（lì）的5hmC标志物（wù）基因组（zǔ）合（hé）的检测性能与传统临床变量（liàng）进行对比分析。最后对相关基因进行了信号（hào）通路（lù）分析和功能探究。

5hmC修（xiū）饰水平与血管并发症具（jù）有（yǒu）相（xiàng）关性

利用逻辑回归模型（xíng）对（duì）62例（lì）有（yǒu）并发症和无并（bìng）发（fā）症2型糖尿病病（bìng）人的（de）5hmC差异水平进（jìn）行（háng）分析发（fā）现，有并（bìng）发（fā）症（zhèng）2型糖尿病病（bìng）人的622个差异修饰候选基因（包括（kuò）上调和下调基因）的归一化平均数（shù）要明显高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一并（bìng）发症和（hé）多发并发症（zhèng）病人之（zhī）间（jiān）没有显著差异。

之后将（jiāng）有（yǒu）单一并发症（zhèng）或多种并发症的50例病人用逻辑（jí）回归模型进行了对比，发现多种并发症的病人的153个差异修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归一化平均（jun1）数要低于无并（bìng）发症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标志物可（kě）区分有无并发症（zhèng）患者

62例2型糖尿（niào）病病人被随机（jī）分（fèn）成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹（dàn）性网络筛选后发现，16基因-5hmC标（biāo）志物（wù）组合检测（cè）可以用于区分有并发症和无并发症的（de）2型糖（táng）尿病病人（rén）。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发现无并发症病（bìng）人的分数在训（xùn）练集和测试集中都明显低于（yú）有并发症的病人。只考虑加权平均分的话，受试者工作（zuò）特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在测试组中中的（de）灵敏（mǐn）度为60%，特异性为100%。

5hmC标志物可区（qū）分病人是单一并发症（zhèng）还（hái）是多（duō）种并发症

50例有并（bìng）发症的2型糖尿（niào）病（bìng）病人被随机分成训练组（n=25）和测试（shì）组（n=25）。利用弹性网（wǎng）络筛选（xuǎn）后（hòu）发现（xiàn），13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖（táng）尿病病（bìng）人是否发生单（dān）一（yī）并（bìng）发症或多种并发症（zhèng）。

基于13基因组（zǔ）合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多种并发症的（de）加权（quán）平均分，发现在训练集和测试集（jí）中单一并发症（zhèng）和多种并发症病（bìng）人的分（fèn）数都有明（míng）显差异（yì）。值（zhí）得（dé）一提（tí）的是，有肾病并发症和无肾病并发（fā）症（zhèng）病人的（de）分（fèn）数（shù）也（yě）有明显差异。利用（yòng）加（jiā）权平均（jun1）分作为判断标准的受试者工作特征（zhēng）曲线（ROC）表明，在测试组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与（yǔ）传（chuán）统临床变量/危险因子的对比

我们评估了不同临床（chuáng）变量/危险因（yīn）子用于监测血管并发症（zhèng）的灵（líng）敏度和特异性（见表1）。

信号通路（lù）分析和功（gōng）能探究

有并发症和（hé）无并发症（zhèng）病人（rén）的（de）135个差（chà）异候选基因的功能注释分析表明，这些基因主要富集在（zài）一些经典的信号通（tōng）路（lù）。错误发（fā）现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路（lù）包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导（dǎo）的信号通路。由IGF1R和IL-10介导（dǎo）的信号（hào）通路与胰岛素抵抗（kàng）及（jí）炎症反应相关，在血管生物（wù）学（xué）和糖尿病发（fā）生发展过程中发挥重要作（zuò）用。

Reactome相互作用（yòng）网络的中心表明，泛素编码（mǎ）基（jī）因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素（sù）A-52亚基核糖体（tǐ）蛋白融合产物（wù）1(UBA52)]是候选（xuǎn）基因（如（rú）SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要（yào）连接者。在这（zhè）135个差异候选基（jī）因中（zhōng）, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关的倾向，表明5hmC和糖尿病血管并发症之间可能存在时间依赖（lài）性的相互作用。基于纵向时间队列的（de）大样本研究，将可进一步明确5hmC变化和（hé）糖尿病（bìng）持（chí）续时间之间（jiān）的动态（tài）关联（lián）。关（guān）于单一并（bìng）发症和多种（zhǒng）并发（fā）症病人的159个（gè）候选（xuǎn）标志基因的功（gōng）能注释研究发现，存在细胞（bāo）-细胞（bāo）连接、胶原蛋（dàn）白形成、新陈代谢、细胞应激应答（dá）信号通路的富（fù）集（jí），这些（xiē）信号通路均与细（xì）胞基（jī）本功能密切相关。

血管并（bìng）发症是三分之二糖（táng）尿病病（bìng）人（rén）的死亡原因，若（ruò）能及早有效控制（zhì）血（xuè）管并发症的（de）发生，将极大地（dì）改善（shàn）糖尿病（bìng）病人的（de）生存质量。该研究建立了一种利用cfDNA进（jìn）行2型糖尿（niào）病血管并（bìng）发症监测的无（wú）创（chuàng）便捷方法，较目前临床标志物能更准确地监控血管并发症的发（fā）生，从而提示临（lín）床及早采（cǎi）取应对（duì）措施，有效控制病情进展。