2019年10月1日，5-羟甲基（jī）化（huà）胞嘧啶（dìng）（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域（yù）取（qǔ）得重（chóng）要进展。2型（xíng）糖尿病（T2D）的血（xuè）管并（bìng）发症是导致2型糖尿病致残致死的重要病因，一（yī）直（zhí）缺乏一种无（wú）创便（biàn）捷（jié）的临床途径实现血管（guǎn）并发症的发生发展（zhǎn）监测，达到早发（fā）现、早干预，以（yǐ）提高T2D病人（rén）的整体生活质量，减少卫生（shēng）经济负担。

该研究（jiū）入（rù）组了62例2型糖尿（niào）病病人，采用5hmC-Seal技术对（duì）血浆（jiāng）cfDNA中表观遗传标志（zhì）物5hmC的分布（bù）情（qíng）况进行检测，分析5hmC标志物与2型糖尿病血管并发症发生（shēng）发展的相关（guān）性。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微血管（guǎn）事件具有相关性，主要涉及（jí）一（yī）些与血管生物（wù）学和糖尿病（包括胰（yí）岛素耐受和（hé）炎症反应）相（xiàng）关的基因和信（xìn）号通路。该（gāi）研究建（jiàn）立的16个基因（yīn）-5hmC标（biāo）志物组合检测可以准（zhǔn）确区分有并发症（zhèng）和无并发症（zhèng）的2型糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明（míng）显优（yōu）于传统临床（chuáng）变量例如白蛋白尿（niào）。除此之外，还建立（lì）了13个（gè）基因-5hmC标志物组合（hé）检测，可以进（jìn）一步区分（fèn）T2D合并单一并发症和多种并（bìng）发（fā）症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他传统（tǒng）临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反映（yìng）了T2D病（bìng）人大血管/微血管并发症（zhèng）发生过程（chéng）中的表观遗（yí）传变化，因而（ér）5hmC-Seal检（jiǎn）测技术在监测糖尿病（bìng）血管并发症（zhèng）发生和进展方面具有良好的（de）临床应用（yòng）前景（jǐng）。

本研究共纳入62例2型糖尿病病人，包括没有（yǒu）血管并（bìng）发症的病人12例，有单一血管并（bìng）发症的病人34例（24例发生大血管事件（jiàn），10例发生微（wēi）血管事件），以及（jí）有（yǒu）多（duō）种血管并发症的病人16例。试验收集（jí）62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外（wài）周血cfDNA中的5hmC序（xù）列（liè），进行二（èr）代测序，通过生物（wù）信息学分析找出并发（fā）症组与无（wú）并发症组之间有显著5hmC修饰差异的基因，单一（yī）并发症（zhèng）组（zǔ）和多种并发症（zhèng）组（zǔ）之间（jiān）有显著5hmC修饰差异的（de）基因。随后（hòu）利用回归模型对差异（yì）基因进一步筛选（xuǎn）、优化，弹性网络进一步筛选，计算加权平（píng）均分，最后得（dé）到一组具有高（gāo）度灵敏（mǐn）度和特（tè）异性（xìng）的5hmC生物（wù）标记物，并（bìng）进一步在（zài）实验组中验（yàn）证，分析其灵敏度（dù）和特异性（xìng）。并将新建立的5hmC标志物基因组（zǔ）合（hé）的检测性能与传（chuán）统临床变量进（jìn）行对比分（fèn）析。最后对相关（guān）基因（yīn）进行了信号通路（lù）分（fèn）析（xī）和（hé）功能探究。

5hmC修（xiū）饰（shì）水平与血（xuè）管并发症具有相关性

利用逻辑回归模（mó）型对62例有并发症和（hé）无并发症2型（xíng）糖尿病病人的5hmC差异水平进行分析发（fā）现，有并发（fā）症2型糖尿病病人（rén）的622个差异修饰（shì）候选基（jī）因（yīn）（包（bāo）括上调和（hé）下（xià）调基因（yīn））的归一化平均数要明（míng）显高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一并发症和多发并发症（zhèng）病人之（zhī）间没有显著差（chà）异。

之后将有（yǒu）单一并发症（zhèng）或多（duō）种并发症的50例病人用逻辑回归模（mó）型进行（háng）了对（duì）比，发现多种（zhǒng）并发（fā）症的病人的153个差异（yì）修饰候选（xuǎn）基（jī）因（yīn）（包括上调和（hé）下调基因）的归一化平均数要低于无并发（fā）症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成（chéng）训练组（zǔ）（n=31）和（hé）测（cè）试组（zǔ）（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛选后发（fā）现，16基因-5hmC标（biāo）志物组合检测（cè）可（kě）以用（yòng）于区分有并发症（zhèng）和（hé）无并发症的2型糖（táng）尿病病（bìng）人。

基于（yú）16基（jī）因组合（hé）模型（xíng） (Detection Model 1) 的加权平（píng）均分分析，发（fā）现无并发症病（bìng）人的分数在训（xùn）练集和测（cè）试集中都明显低于有并发症的病人。只考虑加权平均分的（de）话（huà），受试者工作特征曲线（ROC）分析表明（míng）将cutoff值设置成0.5时，在测试组中中的灵敏度为（wéi）60%，特异性为100%。

5hmC标志（zhì）物可区分病人是单（dān）一并发症还是多种并发症

50例有并（bìng）发症的（de）2型糖尿病（bìng）病人被（bèi）随（suí）机分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网（wǎng）络筛选后发现（xiàn），13基因-5hmC标志物（wù）组（zǔ）合可以区分2型糖尿病病人是否发生单一并发症或多种并发症。

基于13基因（yīn）组合模型 (Detection Model 2)， 我们（men）计算（suàn）了单（dān）一并发症和多种（zhǒng）并发（fā）症的加权平（píng）均分，发现在训（xùn）练集（jí）和测（cè）试集（jí）中单（dān）一并发症（zhèng）和（hé）多（duō）种并发症病人的分数都有明显差（chà）异。值得（dé）一提的是，有肾病并发症和无肾病并发症病人（rén）的分（fèn）数也有明显差异。利用加权平均（jun1）分（fèn）作为判断标（biāo）准的受试（shì）者工作特征曲线（ROC）表（biǎo）明，在测试组中当将cutoff值设成0.69时（shí），灵敏度为（wéi）87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物（wù）与传统临床变量/危险因子的（de）对比

我们评估了（le）不同临床变（biàn）量/危险因子用于（yú）监测（cè）血管（guǎn）并发症（zhèng）的灵敏度和特异性（见表1）。

信号通路分析和功能探究

有并发症和无（wú）并发症病人的135个差异候选基因的功能注释分析（xī）表明（míng），这些基因（yīn）主要富集在一（yī）些经典的信号通路（lù）。错误发现率相关P值（zhí）位于前10%和基（jī）因数目≥3的信号（hào）通路包括由IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所介导的信号通路。由（yóu）IGF1R和IL-10介导的信（xìn）号通路与胰（yí）岛素抵（dǐ）抗及炎症（zhèng）反（fǎn）应（yīng）相关（guān），在血管生物学和（hé）糖（táng）尿病发生发（fā）展过程中发挥（huī）重要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素（sù）编（biān）码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素（sù）A-52亚（yà）基核（hé）糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要连接者。在这135个（gè）差异候选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病（bìng）病程（chéng）相关的倾向（xiàng），表（biǎo）明5hmC和糖尿病血管并发症之间（jiān）可能（néng）存在时间依赖（lài）性的相互作用。基于（yú）纵向时间队列（liè）的（de）大样本研（yán）究，将可进一步明确5hmC变化和（hé）糖尿病持（chí）续时间之间的动（dòng）态（tài）关联。关于（yú）单一并发症和多种并发症（zhèng）病人（rén）的159个候（hòu）选标志基因的功能注释研究发现，存在（zài）细胞-细胞连接、胶原（yuán）蛋白形成、新陈代谢、细（xì）胞应激应答信（xìn）号（hào）通路的富集，这些信号通路均（jun1）与细（xì）胞基本功能密切相关。

血管（guǎn）并（bìng）发（fā）症是三分之（zhī）二糖尿病（bìng）病人的死亡原因，若能及早有（yǒu）效（xiào）控制血管并发症（zhèng）的发（fā）生，将极大地改善糖尿（niào）病病（bìng）人的（de）生存质量。该研究建立（lì）了（le）一种利（lì）用cfDNA进行2型糖（táng）尿（niào）病血管并发（fā）症监测的无创便捷方法，较目前（qián）临床标志（zhì）物能更（gèng）准确地监控血管并发（fā）症的发生（shēng），从而提示（shì）临（lín）床（chuáng）及（jí）早采取应对（duì）措施（shī），有（yǒu）效控制病情进展。